HLA یا Human Leukocyte Antigen آنتی ژن‌های اختصاصی بر روی سطح تمامی سلول‌های هسته‌دار بدن است که ژن‌های کد کننده‌اش بر روی بازوی کوتاه کروموزوم 6 وجود دارد. این مولکول‌ها در زمینه‌های متفاوتی مانند ایمنی علیه عفونت٬ خودایمنی و سرطان نقش دارند. یکی از مهم‌ترین وظایف مولکول‌های گلیکوپروتئینی HLA نقش آن‌ها در شناسایی خودی از غیر خودی و در نتیجه عملکردشان در رد پیوند است. در صورت حضور سلول‌ها با HLA غیرخودی در بدن، سیستم ایمنی بر ضد آن پروتئینی به نام آنتی‌بادی ترشح کرده و منجر به ایجاد یک واکنش ایمنی خواهد شد. هرچه افراد از نظر ژنتیکی به هم نزدیک تر باشند این مولکول‌ها در آن‌ها به هم شبیه‌تر هستند.
ژن های HLA به سه دسته تقسیم می‌شوند:
- کلاس I کلاسیک (HLA-A, -B, -C) که بر سطح تمامی سلول‌های هسته دار بدن بیان می شوند و مسول عرضه آنتی ژن Endogenous (داخل سلولی) به سلول‌های T سایتوتوکسیک می باشند.
- کلاس II با سه حرف نشان داده می‌شوند، حرف اول D که نشان دهنده کلاس٬ حرف دوم M، O، P، Q، R که نشان دهنده خانواده و حرف سوم A یا B که نشان دهنده زنجیره آلفا یا بتا است. به طور کلی پلی مورفیسم زنجیره بتا بیشتر از زنجیره آلفا است و به همین علت تعیینHLA روی زنجیره β انجام می‌گیرد. مولکول‌های کلاس II تنها در سطح سلول‌های B، ماکروفاژها و سایر سلول‌های عرضه کننده آنتی ژن بیان شده و مسول عرضه آنتی ژن‌های Exogenous (خارج سلولی) به سلول‌های T helper هستند.
- كلاس III پروتئين‌هاي سيستم كمپلمان و مسير آلترنیتيو را كد مي‌كنند. كلاس‌هاي I و II در كنترل و تعديل پاسخ‌هاي ايمنی دخالت دارند.
یکی از ویژگی‌های اصلی HLA پلی مورفیسم شدید آن است به طوری که بیشترین میزان پلی مورفیسم در ژنوم انسانی در لوکوس HLA وجود دارد و تعداد آلل‌های شناخته شده به طور مداوم در حال افزایش است به طوری که برای مثال بیش از 4000 آلل شناخته شده تنها برای HLA-B وجود دارد.
از دغدغه های اصلی بیماران پیوندی یافتن دهنده مناسب است. با استفاده از انجام تست‌هایی بر پایه‌ی بررسی HLA دهنده و گیرنده پیوند و گزینش HLA یکسان بین دهنده و گیرنده این دغدغه برطرف می شود.
دپارتمان تخصصی پیوند عضو آزمایشگاه بصیر٬ با بهره‌گیری از کادری مجرب و تکنولوژی روز دنیا (Luminex)؛ آماده ارايه خدمان و انجام آزمایش‌های پیش و پس از پیوند در کمترین زمان ممکن با بالاترین کیفیت در جهت رفع دغدغه بیماران پیوندی می‌باشد.
برای دریافت مشاوره و یا انجام آزمایش‌های پیش و پس از پیوند می‌توانید با مراجعه به آزمایشگاه بصیر و یا همچنین با تماس با شماره 03132212250 و یا 09105295782 قبل از مراجعه به آزمایشگاه پذیرش خود را انجام دهید.
روش تست
تست بررسی HLA یا HLA Typing به چندین روش انجام می‌گیرد:
- روش فلوسیتومتریک / لومینکس
- روش‌های سرولوژیکی: مجاورت لنفوسیت‌های خون فرد با آنتی بادی‌های مختلف در محیط‌های مجزا. به طور مثال اگر بر روی لنفوسیت‌های فرد HLA-A2 وجود داشته باشد٬ در محیط حاوی این آنتی بادی کمپلکس ایمنی تشکیل می‌شود و با میکروسکوپ قابل مشاهده می‌باشد.
- روش‌های مولکولی: با استفاده از تکنیک PCR انجام می‌شود. با کمک این روش می توان از نمونه هایی با حجم کمتر و با ضریب خطای پایین در حداقل زمان ممکن استفاده کرد. انواع روش‌های مولکولی:
Sequence Specific Primers (SSP): روش SSP با استفاده از پرایمرهای اختصاصی توالی به بررسی حضور گروه‌هــای آللی HLA می‌پردازیم. SSP-PCR را می‌توان از جمله روش‌های ملکولی با حساسیت پائین دسته‌بندی نمود. در واقع تکنیک SSP وابسته به تکثیر DNA با استفاده از پرایمرهای اختصاصی آلل یا گروه آللی است که در نهایت می‌توان با شناسایی اندازه باند قطعات تکثیر شده و با استفاده از ژل الکتروفورز به بررسی نتایج تست پرداخت.
Sequence Specific Oligonucleotide Probes (SSOP): این روش مبتنی بر پروب‌های DNA اولیگونوکلئوتیدی سنتز شده و سپس هیبریداسیون آن با قطعات حاصل از تکثیر با PCR است، به طوری که در هر جایگاه ژنی چندین پروب اولیگونوکلئوتیدی بررسی می‌شود. پروب‌ها ممکن است HRP نشانه‌گذاری شده باشند و هیبریداسیون تشکیل شده با استفاده از سوبستراهای کروموژن شناسایی می‌شود. مبنای این روش در شناسایی تایپ HLA هر فرد وابسته به استفاده از یک پنل از پروب‌های اختصاصی است که قابلیت اتصال به توالی آلل اختصاصی DNA تکثیریافته را دارند.
Sequence Based Typing(SBT): این روش به عنوان کامل‌ترین روش در HLA که به دلیل کیفیت بالا روش بسیار کارآمد برای بررسی توالی آلل‌های جدید است. این روش مبتنی بر تکثیر لوکوس یا گروه اختصاصی از اگزون‌های پلی‌مورفیک است و در مراحل بعد تمام قطعات توالی‌یابی می شوند. والی آلل‌های جدید است. این روش مبتنی بر تکثیر لوکوس یا گروه اختصاصی از اگزون‌های پلی‌مورفیک است و در مراحل بعد تمام قطعات توالی‌یابی می شوند.
شناسایی و بررسی آنتی‌بادی‌های ضد HLA
complement-dependent cytotoxicity (CDC) : این تکنیک مبتنی بر لنفوسیت‌های زنده است. جهت بررسی آنتی‌بادی ضدHLA-I ، سلول‌های T وHLA-II نیز سلول‌های B بررسی می‌شوند. تست کراس مچ به روش CDC را نیز می‌توان با افزودن DTT انجام داد که در این صورت آنتی‌بادی‌های IgM تجزیه خواهند شد و در نتیجه تست مثبت فقط ناشی از عملکرد IgG خواهد بود. بایستی به این نکته توجه نمود که حذف پاسخ‌های IgM اقدام مناسبی به نظر نمی‌رسد؛ چرا که بسیاری از آلواتوآنتی‌بادی‌ها از جنس IgM هستند و در نظر نگرفتن این کلاس آنتی‌بادی می‌تواند موفقیت‌آمیز بودن پیوند را با تردید روبه‌رو کند. در این روش تنها آنتی‌بادی‌هایی که قادر به فیکس کردن کمپلمان هستند شناسایی می‌شوند. این روش به نسبت زمان‌بر است و از حساسیت کافی برخوردار نیست. تکنیک فلوسیتومتری که تکنیکی حساس‌تر است، امکان بررسی آنتی‌بادی‌های غیرفیکس‌کننده کمپلمان را نیز فراهم آورده است. هرچند این تکنیک‌ها در بررسی بیمارانی که قبلاً به MHC I & II حساس شده‌اند، مناسب نیست.
غربالگری آنتی‌بادی‌های ضد HLA با استفاده از الایزا: مزایای این روش نسبت به روش‌های مبتنی بر سلول عبارتند از عدم نیاز به نمونه سلولی زنده، امکان بررسی آنتی‌بادی‌های فیکس‌کننده و غیرفیکس‌کننده کمپلمان، امکان گزارش نتایج به صورت نیمه کمی و سرعت بیشتر انجام تست. عمده‌ترین مزیت الایزا امکان بررسی تعداد زیادی نمونه بیمار در مدت زمانی نسبتاً کوتاه است. علاوه بر این، می‌توان به وجود امکان بررسی اختصاصیت HLA II و HLA I نیز اشاره کرد. اگرچه حساسیت الایزا نسبت به روش CDC بالاتر است، اما نسبت به بررسی‌های فلوسیتومتری/لومینکس کمتر است. لازم به ذکر است در این بررسی‌ها تنها آنتی‌بادی‌های ضد HLA شناسایی می‌شوند.
غربالگری و بررسی آنتی‌بادی‌های ضد HLA به وسیله تکنیک‌های فلوسیتومتری/X-Map:روش گلد استاندارد جهت شناسایی آنتی‌بادی‌های ضد HLA که مبتنی بر استفاده از مولکول‌های HLA محلول یا نوترکیب متصل به ذرات پلی‌استرن هستند. بررســی) X-Map لومینکس) در واقع به شناسایی ذرات پلی‌استر رنگ‌شده با دو فلوروکروم مختلف می‌پردازد. بیدها به مخلوطی از آنتی‌ژن‌های HLA متصل شده و سپس با سرم بیمار مجاور می‌شوند. آنتی‌بادی ثانویه انسانی نیز به مولکول ریپورتر متصل و سپس به مخلوط واکنش اضافه می‌شود. دستگاه فلوسیتومتر با بررسی نیمه کمی به بررسی مقدار آنتی‌بادی می‌پردازد. بررسی‌های فلوسیتومتری و لومینکس را می‌توان برای غربالگری و شناسایی در فرمت‌های مختلف استفاده کرد. با استفاده از لومینکس می‌توان هر دو گروه آنتی‌بادی فیکس‌کننده و غیرفیکس‌کننده کمپلمان را شناسایی نمود و همچنین این تکنیک قابلیت شناســایی مستقل HLA-II و HLA-I را دارد. می‌توان از تست‌های لومینکس فلوسیتومتری یا بیدهای فلوسیتومتری جهت بررسی عدم تطابق HLA نیز استفاده کرد. از مزایای دیگر فلوسیتومتری قابلیت شناسایی آنتی‌بادی‌هایی است در تکنیک‌های قبلی قابل تشخیص و بررسی نبودند.
دپارتمان تخصصی پیوند عضو آزمایشگاه بصیر با بهره‌گیری از روش گلد استاندارد لومینکس در کمترین زمان و با بالاترین کیفیت آماده خدمت رسانی به شما عزیزان است. برای پشتیبانی و مشاوره علمی می‌توانید با شماره 03132212250 و یا 09105295782 تماس حاصل فرمایید.
کراس مچ گیرنده-دهنده
وجود آنتی‌بادی علیه آنتی‌ژن‌های دهنده پیوند در سرم گیرنده منجر به وقوع رد پیوند می‌شود. بایستی قبل از انجام پیوند تست کراس مچ انجام شود. این تست با دو روش سایتوتوکسیسیتی وابسته به کمپلمان (CDC) و فلوسیتومتری انجام می‌شود. انجام این دو روش در کنار هم می‌تواند بسیار مفید واقع شود، چرا که هر تست به بررسی آنتی‌بادی‌های مختلفی می‌پردازد.
کراس مچ با روش فلوسیتومتری: انجام تست کراس مچ با روش فلوسیتومتری حساسیت بسیار بالاتری نسبت به روش CDC دارد. در این روش لنفوسیت‌های دهنده با سرم گیرنده انکوبه شده و پس از شست‌وشو به آن آنتی‌بادی anti-human لیبل‌شده با فلوروکروم اضافه می‌شود. جهت بررسی لنفوسیت‌های B و T نیز بایستی یک آنتی‌بادی مونوکلونال دیگر استفاده شود؛ در نهایت پس از شست شو با استفاده از دستگاه فلوسیتومتر میزان وجود آنتی‌بادی ضد دهنده در سرم گیرنده بررسی خواهد شد. بررسی فلوسیتومتری کراس مچ یک روش کارآمد در شناسایی آنتی‌بادی‌های IgG است؛ این روش مناسب بررسی IgM نیست.
